Brza i napredna metoda za analizu većih nukleinskih kiselina pomoću Slalom hromatografije

mRNA terapeutici predstavljaju raznovrstan portfelj za razvoj vakcina i imunoterapija u oblasti raka, kao i terapija „zamene proteina“ (protein replacement terapije). Ključni korak u sintezi mRNA jeste in vitro transkripcija (IVT), proces kojim se iz DNK molekula formira jednolančana mRNA. Iako je enzimski IVT proces efikasan, on dovodi do nastanka dvolančane RNK (dsRNA). Ona predstavlja neželjeni nusproizvod, odnosno kontaminant, koji ugrožava bezbednost i efikasnost finalnog proizvoda. Terapija koja sadrži ovakav kontaminant može izazvati neželjenu aktivaciju imunskog sistema, čak i kada je prisutan u veoma niskim koncentracijama.

Zbog toga je od izuzetne važnosti da se u laboratorijskim analizama koriste tehnike koje su visoko osetljive i koje mogu detektovati kako nukleinske kiseline, tako i kontaminante u malim koncentracijama.

Određivanje nukleinskih kiselina pomoću gelske elektroforeze je rutinska metoda, ali rezultat analize često nije dovoljno osetljiv da bi se detektovale niske koncentracije ometajućih komponenti. S druge strane, ukoliko želimo da uzorke analiziramo pomoću osetljive metode kao što je, na primer, ELISA, koja se zasniva na detekciji dsRNA-specifičnih antitela, analiza zahteva više vremena, jer uključuje veći broj koraka.

Problem nastaje kada je potrebno analizirati veliki broj uzoraka u kratkom vremenskom periodu, što može dovesti do neželjenih grešaka. Takođe, dot-blot metoda je vremenski zahtevna i nedovoljno pouzdana, jer može doći do lažno pozitivnih rezultata usled nespecifične adsorpcije na membranu. U takvim slučajevima analizu je potrebno ponoviti, što u laboratoriji dovodi do dodatnog vremenskog opterećenja i povećane potrošnje laboratorijskog materijala. Zbog ovih nedostataka, kompanija Waters je razvila alternativu agaroznoj gelskoj elektroforezi i kapilarnoj gelskoj elektroforezi, koje se u praksi koriste, sa ciljem unapređenja pouzdanosti i ponovljivosti analize većih molekula nukleinskih kiselina pomoću HPLC sistema.

Šta je slalom hromatografija?

Slalom hromatografija je prvi put primenjena 1988. godine za analizu dvolančanih DNK molekula, ali se zbog tadašnjih izazova, kao što su loša čistoća čestica, veliki gubici uzorka i slaba retencija, nije dalje razvijala sve do danas. Sa brzim razvojem ćelijskih linija, genske terapije i bioinertne ultra-visokopritisne tečne hromatografije (UHPLC), slalom hromatografija je ponovo doživela procvat.

Koja analitička oprema je potrebna za slalom hromatografiju?

Za slalom hromatografiju potreban je UHPLC ili UPLC sistem , kao i odgovarajuća »GtxResolve slalom« kolona, koja je posebno dizajnirana za ovu vrstu analize, jer mora da izdrži visoke pritiske i velike protoke pri kojima se analiza izvodi.

S obzirom na to da se slalom hromatografijom analiziraju nukleinske kiseline koje sadrže komponente osetljive na metal, kompanija Waters je razvila rešenje koje smanjuje adsorpciju komponenti iz uzorka na metalne jone kućišta kolone. Ovo rešenje je realizovano u vidu „Hydrophilic High Performance Surface – HPS“ slalom kolona, kao i sistema Arc Premier (UHPLC), Acquity Premier (UPLC) i Alliance iS Bio kod kojih su sve kapilare u sistemu izrađene primenom HPS tehnologije. Razlog za to je što biomolekuli dolaze u kontakt sa metalom kroz čitav sistem, a ne samo u koloni. Na ovaj način postiže se znatno veća osetljivost analiza u poređenju sa upotrebom samo bioinertne kolone u neinertnom sistemu. Takođe, sva tri sistema su pogodna za rad pri dovoljno visokim pritiscima, koji su od ključnog značaja za slalom hromatografiju (> 9500 psi).

Kako funkcioniše slalom hromatografija?

Slalom hromatografija predstavlja rešenje u oblasti razdvajanja većih nukleinskih kiselina. Može se koristiti u različite analitičke svrhe pri analizi nukleinskih kiselina, uzimajući u obzir njihov oblik, dužinu i tip nukleinske kiseline. Tokom analize, molekuli se u koloni istežu i skupljaju usled kinetičkih sila koje nastaju, čime se omogućava njihovo razdvajanje. Kod ove tehnike redosled elucije je suprotan u odnosu na hidrodinamsku hromatografiju, odnosno veći DNK molekuli se zadržavaju duže u koloni u poređenju sa manjim, koji se eluiraju kasnije. Slalom hromatografija je dobila naziv po olimpijskom sportu slalom, u kojem skijaši vijugaju između prepreka.

U koloni molekuli nukleinskih kiselina, tokom kretanja od početka ka kraju kolone, prolaze pored prepreka i na taj način formiraju takozvani „slalom“. Fleksibilnije molekule, kao što je jednolančana RNK, lakše i brže se kreću između prepreka, pa se zbog toga eluiraju prve. Nasuprot tome, veći molekuli, poput dvolančane RNK, imaju više poteškoća pri manevrisanju između prepreka, jer se zbog svoje veličine sudaraju sa njima, što ih usporava. Zbog toga se veće molekule eluiraju kasnije.

Kod slalom hromatografije nije važno samo kretanje molekula, odnosno razdvajanje prema veličini, već i činjenica da molekuli zadržavaju izdužen oblik uprkos visokim smičućim silama koje nastaju pri visokom pritisku i velikom protoku. Za slalom hromatografiju pogodne su dvolančane molekule RNK i DNK koje su veće od 4 kbp.

Kretanje molekula u slalom koloni – prikaz na mikroskopskom nivou:

Slalom hromatografija: novi pristup i poređenje sa gelskom elektroforezom

Kod tradicionalne metode analize nukleinskih kiselina pomoću gelske elektroforeze dolazi do kretanja naelektrisanih čestica kroz umreženi gel pod uticajem električnog polja. Pošto DNK molekul poseduje električni naboj, on se u gelu može razdvajati prema veličini, jer gel otežava kretanje većih molekula. Nasuprot tome, kod HPLC slalom hromatografije, kao što je prethodno opisano, razdvajanje nukleinskih kiselina zasniva se na kinetičkim silama.

Kako bismo uporedili efikasnost slalom hromatografije i agarozne gelske elektroforeze, prikazana je analiza lestvice od 0,5 µg nukleinskih kiselina 23 kbp dsDNK, koja je sadržala fragmente veličine 2; 2,3; 4,3; 6,5; 9,4 i 23 kbp, uz upotrebu 1× TAE pufera, pri protoku od 1,30 mL/min, pritisku od 10.820 psi i temperaturi od 40 °C. Komponente uzorka praćene su na osnovu njihove apsorbance na talasnoj dužini od 260 nm.

Rezultati razdvajanja pojedinačnih dsDNK komponenti, dobijeni na slalom koloni GTxResolve 250 Å (4,6 × 300 mm), upoređeni su sa rezultatima dobijenim agaroznom gelskom elektroforezom (slika 1).

Slalom hromatografijom se uspešno razdvajaju nukleinske kiseline veće od 4 kbp za 3,5 minuta

Dok su fragmenti dsDNK veličine > < 4 kbp na agaroznem gelu dobro ločeni, je bila ločljivost večjih fragmentov (> 4 kbp) izrazito boljša na koloni GTxResolve 250 Å, pri čemer smo opazili 4,5-kratno izboljšanje v ločljivosti pri fragmentih od 9,4 do 23 kbp. Ti rezultati jasno potrjujejo primernost in uporabnost slalom kromatografije za analizo velikih dsDNA molekul, večjih od 4 kbp. Prav tako je čas ločbe pri slalom kromatografiji bistveno krajši 3,5 min v primerjavi s tradicionalno elektrofozero, pri kateri porabimo 60 minut.

 

 

Agarozni gelovi često zahtevaju dodatne korake optimizacije. Na primer, preporučeni uslovi od strane proizvođača ne moraju uvek dati očekivani broj profila. Da bi se postigao optimalan i makar delimično ponovljiv rezultat, često je potrebno prilagoditi udeo agaroze, obradu uzorka i količinu nanetog uzorka. Pored toga, greške pri pipetiranju dovode do toga da je ova tehnika više kvalitativna nego kvantitativna.

 

 

 

Slalom hromatografija, u poređenju sa tradicionalnim metodama kao što je gelska elektroforeza, omogućava superiorno razdvajanje, rezoluciju i efikasnost detekcije u vremenu kraćem od pet minuta za veće nukleinske kiseline (> 4 kbp). Priprema HPLC sistema se pritom suštinski ne razlikuje od pripreme za druge tehnike tečne hromatografije.

Takođe, jedna od prednosti slalom hromatografije jeste to što je za kvalitetno razdvajanje dovoljna već i mala količina uzorka, poput 10 ng.

Uvođenjem slalom hromatografije možete analizirati veće nukleinske kiseline primenom najsavremenije tehnike, uz „in-house“ znanje i poverenje u ponovljive i visoko osetljive rezultate koje pruža Waters oprema.

Slalom kolone prilagođene visokoj robusnosti – sa prilagođenom stacionarnom fazom i metalnim kućištem

S obzirom na to da se u laboratorijskom radu teži smanjenju nepotrebnih troškova, životni vek kolone je od izuzetnog značaja. Slalom hromatografija se izvodi pri visokim pritiscima (npr. 10.750 psi), velikim protocima (npr. 1,3 mL/min) i povišenim temperaturama (40 °C). Kako su molekuli pri nižim temperaturama viskozniji, može doći do porasta pritiska, zbog čega se preporučuje odgovarajuće podešavanje temperature u koloni. Zbog ovih radnih uslova, stacionarna faza slalom kolona je optimizovana za izuzetnu robusnost, inertnost, efikasnost, rezoluciju i ponovljivost između različitih proizvodnih serija kolona.

Inertnost metalnog kućišta sa „Hydrophilic High Performance Surface – HPS“ tehnologijom doprinosi boljem iskorišćenju, ponovljivosti i razdvajanju, jer se smanjuje adsorpcija problematičnih komponenti iz uzorka na metalne jone kućišta kolone.

Bezbednost zaposlenih pri analizi nukleinskih kiselina

Prednost slalom hromatografije je u tome što za uspešnu analizu nije potrebna upotreba toksičnih reagenasa, kao što su etidijum-bromid, akrilamid, fenol i hloroform.
Slalom hromatografija predstavlja brzo i veoma osetljivo UHPLC/UPLC rešenje za detekciju velikih molekula nukleinskih kiselina i dsRNK kontaminanata u mRNA terapeuticima koji nastaju tokom in vitro transkripcije. U poređenju sa agaroznom gelskom elektroforezom, slalom hromatografija obezbeđuje značajno bolje razdvajanje velikih nukleinskih kiselina (> 4 kbp), do 4,5 puta bolju rezoluciju velikih dsDNK fragmenata, veoma kratko vreme analize (≈ 3,5 min) umesto približno 60 minuta, kao i visoku osetljivost već pri 10 ng uzorka, uz istovremeno bolju ponovljivost i kvantitativnost. Metoda je robusna, slalom kolone imaju dug radni vek, a sama tehnika je bezbednija za laboratorijsko osoblje jer ne zahteva upotrebu toksičnih reagenasa poput etidijum-bromida, akrilamida, fenola ili hloroforma.

Autorka članka je Simona Ribizel, prodajna predstavnica u kompaniji Labtim, koja se u svom radu fokusira na podršku laboratorijama pri izboru i optimizaciji potrošnog materijala, kao i na rešavanje praktičnih izazova u analitičkim procesima.

IZVORI:

1. Retention mechanism in combined hydrodynamic and slalom chromatography for analyzing large nucleic acid biopolymers relevant to cell and gene therapies https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967324004497
2. Theoretical predictions to facilitate the method development in slalom chromatography for the separation of large DNA molecules https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967324007532
3. Gel elektroforeza
   http://www-f1.ijs.si/~rudi/sola/seminar-Parkelj.pdf
4. Gel Electrophoresis Safety
   https://www.safety.rochester.edu/
5. A New Alternative to Gel Electrophoresis: Higher Resolution and Faster Analysis of Large Nucleic Acids by Rigorously Designed GTxResolve^TM 250 Å Slalom Columns
   https://www.waters.com/nextgen/us/en/library/application-notes/2025/a-new-alternative-to-gel-electrophoresis-higher-resolution-and-faster-analysis-of-large-nucleic-acids-by-rigorously-designed-gtxresolve-250-slalom-columns.html
6. Rapid and Sensitive Detection of dsRNA Contaminants in mRNA Using the GTxResolve™ 250Å Slalom Chromatography Column
   https://www.waters.com/nextgen/us/en/library/application-notes/2025/rapid-and-sensitive-detection-of-dsrna-contaminants-in-mrna-using-the-gtxresolve-250a-slalom-chromatography-column.html

NAPOMENA: Sadržaj ovog članka namenjen je opštem informisanju i nema naučni ili istraživački karakter. Pre uvođenja bilo kakvih izmena u radne postupke, preporučuje se stručna procena u saradnji sa našim stručnim timom, u skladu sa specifičnim zahtevima vašeg laboratorija.